《Nature Microbiology》：冷冻电镜多技术联合揭秘蓝舌病毒感染细胞的“魔法钻头”

病毒进入宿主细胞的过程，就像一个没有钥匙的小偷想要悄悄进入一个房子。那些有脂质包膜的病毒，例如人类免疫缺陷病毒（HIV）和SARS-CoV-2等，好比是拥有一把“魔法钥匙”的小偷，这把钥匙能让它们轻松地和房间的门融合（有包膜的病毒一般能够通过两种方式进入细胞，一种是宿主进行的内吞，另一种是将自己的包膜和宿主的细胞膜融合。许多情况下内吞后也会发生膜融合），从而悄无声息地进入房子里。这种情况下，房子的门依然完好无损。而对于像蓝舌病毒（BTV，图1）这样没有“魔法钥匙”的小偷（即没有脂质包膜的病毒），它们则需要通过其他机制进入细胞，但这种机制尚不清楚。

在病毒分类上，BTV属于呼肠孤病毒家族的环状病毒，这类病毒的内衣壳由32个像甜甜圈一样的环形组成，因此得名“环状”。蓝舌病毒的基因组由10条独立的双链RNA组成，被多层蛋白质衣壳包围；但与其他虫媒病毒不同，它缺乏脂质包膜。BTV本身主要通过其宿主「蠓」（图1）在欧洲的牛、羊中传播，但这一家族的其他成员可能导致多种人畜共患病，通常表现为发热、神经炎、肌肉酸痛、腹泻等症状，并曾致人死亡。

2021年，来自加州大学洛杉矶分校（UCLA）的周正洪教授团队等人在Nature Microbiology上发表重要研究成果：Bluetongue virus capsid protein VP5 perforates membranes at low endosomal pH during viral entry，通过改变冷冻电子显微镜制样过程中的pH值，并将冷冻电镜领域的“两大利器”——冷冻电镜单颗粒分析（cryo-EM SPA）和冷冻电子断层扫描（cryo-ET）技术相结合，成功捕捉、可视化了蓝舌病毒与细胞内吞体膜相互作用的中间状态，结合结构导向的突变分析复现了低pH条件下蓝舌病毒通过其外层衣壳蛋白触发细胞膜穿透机制的详细过程。

一、BTV在低pH环境下的结构变化

研究人员在酸性环境下将蓝舌病毒（BTV）与脂质体（双层脂质分子组成的微团，用于模拟细胞膜的状态）一起观察，并拍摄了冷冻电镜图像。通过对这些图像进行单颗粒分析，研究人员能够详细地观察并区分组成BTV病毒粒子最外层（outer）以及中层（intermediate）衣壳的三种重要蛋白——受体结合蛋白VP2，膜穿透蛋白VP5，和衣壳蛋白VP7——在不同功能状态下的三维结构。

2D图像和三维重建的结果清楚地展示了BTV外层蛋白在不同条件下的三维结构。研究人员发现，在低pH值的酸性条件下，BTV表面蛋白的结构与高pH值的碱性条件下有很大不同。之前在pH=8.8条件下的研究显示，每个病毒颗粒包含120个球形的VP5三聚体，而每个VP5单体由三个区域组成：匕首形区域（dagger）、展开区域（unfurling）和锚定（anchoring）区域。而在低pH值条件下，VP5三聚体（图1，绿色）变成了一种带有从三角形基座突出的茎状（stalk）的延长形状；每个单体原先的锚定结构域中位于表面的一个环（由氨基酸A409至A421组成）变形为β发夹结构，插入到相邻的两个VP7三聚体（黄色）形成的凹槽中。这样形成的稳固的分子连接将VP5锚定在其“座位”上。

在一个不对称单元中，两种VP5三聚体（图1，1和2，分别体现为绿色和蓝色）的结构几乎相同，只是在起锚定作用的β发夹和它们周围的VP7三聚体的相对位置上有轻微差异。因此，研究人员决定只关注VP5三聚体1。

图1：蓝舌病毒的衣壳蛋白基本结构，包括内层VP3，和VP7与VP5

二、四种结构态的捕获

BTV在较低pH的环境条件下共有四种结构状态。这四种状态在 VP7蛋白 （黄色）的所有结构域和VP5蛋白（绿色）的锚定结构域方面保留了共同特征，但在VP5三聚体的形态和VP2蛋白的有无方面存在差异。其中，随着pH的降低，VP2蛋白会逐步从病毒粒子的最外侧解离下来，而位于一个VP5三聚体两侧的VP2蛋白都消失的结构则代表了最终的低PH（Low-pH） 状态（图3，最右侧）。其他三种结构，即 VP2 两侧均保留、仅“左”侧保留或“右”侧保留，分别称为中间状态 1（IMS1）、2（IMS2）或 3（IMS3）。

图2：蓝舌病毒在不同pH条件下（从左到右：从高到低）的衣壳蛋白结构变化

与它们在高pH值状态下的病毒颗粒上的结构相比，在较低pH值状态下捕获的VP5三聚体在构象方面发生了剧烈变化。其中，在IMS1 和 IMS2中VP5 三聚体表现出相同的结构，三个VP5亚基中只剩下一个的展开结构域（VP5 unfolding，红色，图3）继续与同一亚基的锚定结构域（VP5 anchoring，绿色）相互作用。相比之下，在 IMS3 和最低 pH 的状态下，VP5 三聚体中所有三个亚基的展开结构域都会与锚定结构域分离，并向外合拢，形成一个向外伸出的竖长柄（就是我们之前所看到的“茎状延长结构”stalk）。该柄是一个由六个螺旋组成的卷盘束，类似于病毒学中“第一类膜融合蛋白”（如新冠病毒的S蛋白spike）的融合后状态。

图3：VP5蛋白从高pH状态到低pH状态的结构发生了显著变化

三、VP2、VP5和VP7互作的结构变化

在非酸性环境下，VP5与VP7的相互作用十分紧密，VP5的三个不同结构域（即匕首结构域dagger、展开域unfurling和锚定域stem helix）都参与到与VP7的结合中，整体结合面积相当大（每个VP5三聚体的总埋藏表面积为8000Å2）。然而，当病毒暴露于酸性环境下后，就像我们刚才所看到的那样，VP5的「匕首」结构域“消失”了（在冷冻电镜重构模型中无法确定，表明其结构稳定性差），而三个茎部螺旋与展开域的一部分结合形成了一个更长更紧凑的螺旋束。

图4: 在酸性条件下，包围着VP5三聚体的六个 VP7 三聚体中，有两个（VP7-A 和 VP7-F）向着病毒的五重对称轴发生了移动（箭头）。同时，VP5 三聚体的构象发生了两种明显变化：首先，VP5 三聚体的所有三个亚基（VP5-A 至 VP5-C）的螺旋结构（氨基酸 P90 至 N135）都重新折叠成柄，然后，锚定结构域向基座方向展开约20°（仅在侧视图明显可见）

此时，VP5的锚定结构域向病毒中心旋转了约20度，与VP7的相互作用也发生了变化，只有锚定域继续与VP7相互作用。另外，高pH状态下被隐藏在VP5内部的β－发夹结构，现在已经插入到两个邻近的VP7三聚体的接口中（图5，粉色）。这些相互作用的变化导致VP5三聚体与VP7衣壳蛋白的结合面积大幅减小（VP5三聚体的总埋藏表面急剧收缩到3430Å2），从而使整个VP5三聚体更容易从BTV核心脱离。

图5：左图高pH条件下的Dagger和右图低pH条件下的hairpin等表现了VP5蛋白不同结构域的变化情况

四、VP5转变的原子分辨率细节

低 pH 环境下发生构象变化的三种蛋白中，VP5 的结构在两种 pH 值条件下不同。在 VP5 三聚体中，三个亚基乎完全相同，只是在β－发夹上略有不同。在一个亚基中的结构域中，只有两种 pH 条件下的锚定结构域保持不变（图6，彩色和灰色结构的叠加仅在绿色部分成立）；其他两个结构域——匕首结构域和展开结构域——都发生了急剧的构象变化。首先，高pH值条件下的匕首结构域在 N 和 C 端分别稳定。然而，原本被β3和β9夹在中间的β2在低pH环境时重新折叠成了位于锚定结构域顶端的α－螺旋（图6c）。在低 pH 值时，匕首结构域在很大程度上是易变的，有可能与膜相互作用。其次，展开结构域和锚定结构域中的表面环通过未质子化的组氨酸残基——pH 传感器在高 pH 环境下堆叠在一起。在低 pH 值时，这些组氨酸残基的质子化导致展开结构域和表面环从锚定结构域解离。被释放的三个展开结构域随后捆绑成一个向外突出的柄。

图6: VP5三聚体蛋白在低 pH 环境下的构象变化

另外，在转入低ph条件下时，VP5从 A409 到 A421 的环旋转 110°，转变成一个β夹（黄色，图6b，e）。VP5 三聚体新形成的三个β夹各自插入对应的下层VP7蛋白的凹槽中，将 VP5 三聚体固定在 BTV 中心。除了VP5 和VP7 β链之间的主链相互作用外，VP5 的 Gln418 侧链与 VP7 的 Arg218 和 Arg221 侧链之间的氢键、VP5 和 VP7 围绕 VP5 上残基 A416 和 A420 的疏水相互作用以及 VP7 R218 侧链与 VP5 W411 的吲哚环之间等一系列非共价相互作用也使得β夹更加稳定，从而将VP5继续固定在VP7病毒衣壳之上。

这些相互作用构成了 VP5 三聚体与周围 VP7 三聚体之间总计约 1,650 Å2 的埋藏区域。这一区域的相互作用是维持 VP5 与 BTV 核心接触的主要因素。与高 pH 环境时的 BTV 结构相比，低 pH 环境时参与 VP7 相互作用的 VP5 残基在高 pH 环境下与VP7 没有接触。为了检验这些相互作用对病毒复制的意义，研究者还基于搭建的结构模型进行了一系列精确的诱导突变研究（图6f）。

五、BTV与脂质膜的相互作用

研究者使用Cryo-ET（冷冻电镜断层成像）和子断层平均法（subtomogram averaging，STA，通过叠加Cryo-ET原位成像图中的相同分子亚单位解决其图像信息和分辨率不足的问题）探讨了 BTV 在暴露于低 pH 值后如何与膜相互作用。三维层析成像的切片探索出了病毒和脂质体的特征。研究人员发现，在中性 pH 值条件下，大多数颗粒都是完整的病毒；在高pH环境下亦然。这两种情况下，由于脂质体上没有受体，没有病毒颗粒与膜发生相互作用。然而，在低pH值条件下，BTV会发生结构重排，并形成一个中间体，从病毒核心伸出长柄，这与上述单颗粒冷冻电镜重建的高分辨率结构一致。将 pH 值从 5.5 调回 7.5 并没有逆转这些结构重组。完整病毒的比例从中性 pH 值时的 85% 降至低 pH 值时的15%，当 pH 值变回中性时甚至进一步下降。

图7：原位成像揭示BTV在低pH下通过VP5蛋白和脂质体膜发生相互作用

六、揭秘BTV“钻孔”跨膜行为的过程

在低pH环境下与膜相互作用后，BTV颗粒接近脂质体膜，并依靠VP5蛋白的结构变化在柄－膜相互作用的部位形成一个单孔。这种单孔而非大面积穿孔膜的形成与之前的生化实验相吻合，实验表明在低 pH 值条件下，病毒可以使10 kDa的荧光分子从囊泡中释放出来，但不能使40 kDa的荧光分子从囊泡中释放出来。在Cryo-ET的成像中，可以看到脂质体上附着部位的孔隙似乎能够进一步扩大，直到允许完整的病毒颗粒通过（图7h）。

通过冷冻电镜断层成像（Cryo-ET）和子断层平均法STA分析，我们可以发现VP5的茎尖部分在PH防止后发生的变化使其能够插入到细胞膜中。因此，研究者们提出了一个假设性的VP5全长模型，将其主要的膜结合位点定位在茎尖的一段碱性和疏水序列（R250–K260）上，因为这段序列与磷酸肌醇（phosphoinositide, PI）结合基序（K/R-(Xn=3–7)-KXKK）相似，有可能绑定带负电的脂质。为了评估这个膜穿透元素以及之前所发文章中提出的“WHXL”特定基序（被认为可以和目标膜上的脂筏结构互作）的功能，研究者在BTV基因组中引入了两个位于茎尖的突变（K259E, K260E）和一个对WHXL基序的突变（L414A），并进行了反向遗传学实验，发现转染突变基因组均无法产生感染性病毒。接着，研究人员对两种VP5突变蛋白（L414A和K259E）进行了纯化，并进一步通过脂质体释放实验检测它们的膜穿透活性。实验的结果显示，低pH下VP5的活性分别因为L414A和K259E突变而减少了约47%和33%。而采用VP5三重突变（H384A/H385A/H386A）作为对照的实验显示，膜穿透活性减少了66%。此外，之前的研究结果显示低pH使VP5的匕首结构域释放成为自由状态，也解释了前人研究中观察到“匕首结构域”所具备的膜穿透活性。 

综合这些结构和生化数据表明，VP5的三个元素——茎尖部分（R250–K260）、WHXL基序和匕首结构域——必须共同作用，才能使病毒穿透内体膜，将其核心释放到宿主细胞的细胞质中。

这项研究表明，蓝舌病毒携带了一种特殊的“感应器”（VP5蛋白），这个感应器能够在特定条件下（比如低pH值，相当于房子周围环境变得酸性）激活并变化形态，就像小偷突然长出了能够钻孔的“钻头”。这时，蓝舌病毒利用这个“钻头”在房子的门上钻了一个小孔，然后通过这个小孔悄悄溜进了房子（细胞）。本研究就像是安装了监控摄像头，首次捕捉到了这个没有“魔法钥匙”的小偷如何变出“钻头”，在门上钻孔，然后进入房子的整个过程。

在本项研究中，冷冻电子显微镜技术发挥了至关重要的作用，为揭示BTV在低pH条件下触发的膜穿透机制提供了结构基础。通过在不同pH条件下对BTV进行冷冻电镜成像，研究团队成功捕获了病毒与内体膜相互作用的中间状态，这一成就在技术上极具挑战性。冷冻电镜技术的应用，特别是结合单颗粒分析（single-particle analysis）和冷冻电层断层成像（cryo-ET）技术分析蓝舌病毒在不同PH条件下的原位结构，使得研究人员能够以原子级分辨率揭示BTV结构的动态变化，从而深入理解其低pH感应、结构重排、膜插入、孔形成以及病毒通过孔的过程。

本研究提供了在领域内，首个关于BTV低pH触发膜穿透过程中间状态的结构描述，这一成果填补了之前研究中的空白。通过冷冻电镜技术，研究人员不仅揭示了病毒结构在低pH条件下的变化，而且还展示了病毒如何感应环境pH的变化并通过一系列结构重排来实现对宿主细胞的侵袭。这些发现对于理解病毒如何适应并利用宿主细胞的内部环境具有重要意义，为未来的病毒学研究和抗病毒药物的开发提供了宝贵的信息。

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